李玉芙出身于梨园世家。父亲艺名李妙兰，是喜连成第一科“喜”字辈学生，学的是青衣。后来，投师于吴菱仙及陈德霖门下，除与梅兰芳、姜妙香等有同门之谊，并曾同台献艺外，较长时间与时慧宝合作。后来在东北教戏，学生中有云燕铭、秦友梅等。李玉芙有七位哥哥，除四哥从事杂技专业之外，大哥、二哥、三哥、五哥、七哥都曾活跃在京剧舞台上。李玉芙幼年丧母，十三岁丧父。

为了生计在哈尔滨京剧团当学员，梅兰芳赴哈演出期间，特意为她到北京报考戏校留下了路费。后来，马连良、袁世海在哈演出期间又亲笔写信，介绍她报考北京市戏曲学校的前身《艺培戏校》。在校期间，曾作为少先队代表，参加慰问解放军代表团。1957年又被选派赴莫斯科参加世界青年联欢节，主演《廉锦枫》。1959年，以“三好生”的优异成绩，毕业于北京戏校。为首届毕业生。毕业后被分配到梅兰芳京剧团工作，受到梅先生亲自教导，在梅先生的亲自安排下，与姜妙香、刘连荣、王少亭同台演出。并在新编历史剧《柳常青》、《龙凤环》中，担任女主角。

曾主演《贵妃醉酒》、《宇宙锋》、《奇双会》、《霸王别姬》、《生死恨》、《凤还巢》、《穆桂英挂帅》等梅派名剧。系梅兰芳亲传弟子，梅派传人。